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小鼠体外受精实验步骤及培养失败原因分析

发布时间:2019-04-02

一:小鼠促排卵

1、每只雌鼠 (8-12 周龄) 注射 PMSG 5IU(0.1 ml)。(一般在 14:00 —18:00 之间注射)。
2、48 小时后注射 hCG 5IU(0.1 ml)。
3、在注射 hCG 后 14-16 h 进行受精,最好不超过 15 h,约早 9 点-11 点杀鼠取卵。


二:受精皿准备
1、按下图准备培养皿,放于二氧化碳培养箱中平衡过夜。
注:卵子受精皿按 3 只小鼠/皿计算做盘。


三、精子获能

1、取卵当日先杀雄鼠取附睾尾部精子获能。快速颈椎脱臼法处死雄性小鼠。
2、成年小鼠的睾丸大约有一粒黄豆大,在睾丸下方一点与睾丸相连的位置,能看到白色附睾,能看到其内有许多曲精小管。
3、找到睾丸后附睾后,迅速用眼科剪和眼科镊将附睾及输精管剪下置于精子获能滴中,用注射器针头将附睾尾划破捣碎,待全部精子溢出后,培养箱孵育 10 min,取出体视镜下观察,精子扩散后,放入培养箱继续孵育 50 min 后可用
      
           在获能液中的附睾尾                          精子从附睾尾部溢出

四、取卵

1、精子获能后立即用 M2 培养液在 3001 培养皿内做数个 200ul 捡卵滴,矿物油覆盖,置于 37℃ 加热平板上加热 30 分钟。M2 培养液含有 HEPES,可以在二氧化碳培养箱外维持 pH 值稳定。
2、精子获能 50 分钟后,快速颈椎脱臼法处死雌性供体小鼠。将小鼠放在吸水纸上,用 75% 的乙醇消毒腹部。
3、用第一套眼科镊捏住皮肤并用眼科剪在皮肤上做一小切口。然后用力将皮肤拉到头部,完全暴露腹部。然后用第二套器械剪开腹膜,完全暴露内脏器官。将肠管拉向一侧后即可在腹腔中见到两侧的子宫和相连的卵巢。卷曲的输卵管在卵巢和子宫之间。(注意不能用剪开皮肤的眼科剪和眼科镊去剪腹膜和输卵管,防止出现污染)


五、授精
1、用口吸管和灭菌 1.5 mm 毛细玻璃管将 COCS 转移到 HTF 清洗皿内,反复吹打,尽量洗去 HEPES。
2、转移至 HTF 受精皿内,每个滴放 2 团 COCS。
3、用移液枪从精子获能皿中吸取 3ul 精子加入授精滴内。精子密度 1-5×10^6 为宜(以放入培养箱中 10 min 后能看到 COC 被精子打散,精子能推动 COC 运动即可)。
4、整个受精过程以 5 min 内完成为宜(杀鼠到受精入箱)。

5、受精 3-4 h 后,用 1.5 mm 毛细玻璃管拉制的直径 100um 吸管将受精卵从受精滴中移入 KSOM 培养皿液滴中,反复吹打,直至透明带上基本无精子残留,移到一个新滴中继续培养 4 h,观察原核形成情况,以形成原核和排出 PB2 为受精标志,计算受精率。

六、培养失败的原因查找
1、超数排卵后获得卵少:检查小鼠周龄,建议 3-10 周。检查 PMSG、hCG 效期,不能反复冻融。
2、受精率低-2cell 率低-囊胚形成率低
(1)检查培养箱状态:检测培养箱二氧化碳浓度是否为 5%,温度是否为 37℃。胚胎培养比细胞培养难度大,培养环境一定要满足条件。
(2)雄鼠周龄:雄鼠一定要大于 10 周,并且获能后一定要观察是否有大量精子游动。
(3)操作熟练度:从杀鼠到受精放入培养箱以 5 min 内完成为宜。
(4)矿物油:培养环节中最容易被忽视的就是矿物油质量,劣质矿物油或矿物油保存不当均会导致培养失败。