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水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA

发布时间:2019-02-19

目的

学习水平式琼脂糖凝胶电泳,检测DNA的纯度,DNA的构型,含量以及分子量的大小。

原理

水平式琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中最常规的实验方法,它简单易行,只需少量的DNA就能检测,其分辨效果比分光光度计法与溴化乙啶-标准浓度DNA比较法更高,更直接,检测DNA范围更广,其原理是溴化乙啶在紫外光照射下能发射荧光,当DNA样品在琼脂糖凝胶中电泳时,琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分子中形成荧光络合物;使得DAN发射的荧光,增强几十倍。而荧光的强度正比于DNA的含量,如将已知浓度的标准样品做琼脂糖凝胶电泳的对照,就可比较出待测样品的浓度。若用薄层分析扫描仪检测,则可精确地测得样品的浓度。电泳后的琼脂糖凝胶块直接在紫外光下照射拍照,只需5~10ng DNA ,就可以从照片上比较鉴别。如肉眼观察,可检测到0.01~0.1ng的DNA。

在凝胶电泳中,DNA分子的迁移速度与分子量的对数值成反比。质粒DNA样品用单一切点的酶酶切后与已知分子量大小的标准DNA片段进行电泳对照,观察其迁移距离,就可以该样品的分子量大小。凝胶电泳不仅可分离不同分子量的DNA,也可鉴别分子量相同,但构型不同的DNA分子。在抽提质粒的过程中,由于各种因素的影响,使得超螺旋共价闭环结构的DNA(SC)的一条链断裂,变成开环(OS)分子,如果两条链发生断裂,就变成线形分子(L)分子。这三种构型的分子有不同的迁移率。在一般情况下,超螺旋迁移速度最快,其次为线形分子,最慢的为开环分子。

当提取到的质粒DNA样品中还有染色体DNA或RNA,在琼脂糖电泳上也可以分别观察到电泳区带,由此可以分析样品的纯度。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时,有电荷效应与分子筛效应,前者由分子所带净电荷的多少而定,后者则主要与分子大小及构型有关。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电荷。在电场中向着正极移动,在用电泳法检测DNA分子时,应当尽量减少电荷效应。增加凝胶的浓度可以在一定程度上降低电荷效应,使得分子的迁移速度主要由分子受凝胶阻滞程度差异所决定,提高分辨率。同时适当降低电泳时的电压,也可以使分子筛效应相应增强而提高分辨率。

试剂与器材

一、试剂

1、  DNA样品

2、  TBE缓冲液(5×):用时需稀释10倍

3、  点样缓冲液Loading buffer(10×):0.25%溴酚蓝,40%甘油

4、  溴乙啶染色液(EB):10mg/ml溴乙啶 注意:该试剂具致癌作用,用时要小心。

5、  琼脂糖

二、器材

1、  电泳仪系统

2、  紫外灯

3、  恒温水浴箱


操作步骤

1.  选择合适的水平式电泳仪,调节电泳槽平面至水平,检测稳压电源与正负极的线路。

2.  选择孔径大小适宜的点样梳,垂直架在电泳槽负极的一端,使得点样梳的底部与电泳槽水平面的距离为0.5~1.0mm。

3.  制备琼脂糖凝胶:按照被分离的DAN分子的大小,决定凝胶中琼脂糖的百分含量。一般情况下可参考下表:

琼脂糖的含量(%)

g/ml

分离线状DNA分子的有限范围(kb)

0.3

60~5

0.6

20~1

0.7

10~0.8

0.9

7~0.5

1.2

6~0.4

1.5

4~0.2

2.0

3~0.1

称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中,一般配制约40ml 凝胶液,置微波炉中或水浴加

热,至琼脂糖融化均匀。

4.   将凝胶槽洗净擦干,两端用胶布封好,在一端插好梳子。待凝胶溶液冷却至60℃

       左右时,在凝胶溶液中加EB(EB最终浓度为0.5 μg/ml),摇匀,轻轻倒入电泳槽水平板上,除掉气泡。待凝胶完全凝固后,去掉两端封条,将凝胶槽移至电泳槽(槽中已加入TBE缓冲液),然后小心地拔掉梳子保持点样孔完整。

注意:电极缓冲液要高出凝胶面2-5㎜。

5.  待测的DNA样品中,加入1/5体积的点样缓冲液,混匀后小心的进行点样,记录样

品点样顺序和点样量。

6.  开启电源开关,最高电压不超过5V/cm。

7.  电泳时间看实验的具体要求而异,在电泳中途可用紫外灯直接观察,DNA各条区带

分开后电泳结束。一般20min—3 h,取电泳凝胶块直接拍照。